1、將標準品和樣品對應的微孔編號，每個標準品和樣品做雙孔平行，并記錄標準品和樣品的位置。 
2、在標準品孔中加入 50μl 各標準品溶液，在各樣品孔中加入 50μl 樣品溶液。 
3、在所有孔中加入 50μl 的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻， 25 ℃環境中避光反應 30 分鐘。 
4、小心揭開蓋板膜，甩干孔中液體，用稀釋好的洗滌液（ 250μl/ 孔）充分洗滌微孔板 3 次，在吸水紙上拍干（拍干后未清~除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。 
5、在所有孔中加入 100μl 的酶標二抗，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻， 25 ℃環境中避光反應 30 分鐘。取出酶標板，按步驟 4 洗板 5 次。 
6、洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入 50μl 底物液 A ，再加 50μl 底物液 B ，輕微晃動反應板使之徹底混勻， 25 ℃環境避光顯色 15 分鐘 ( 在顏色淺的情況下可適當延長反應時間，但總顯色時間不要超過 30 分鐘 ) 。 
7、每孔中加入 50μl 終止液，輕輕晃動使之徹底混勻，在 450nm （建議使用雙波長 450/630nm ）下檢測吸光度，結果在 5 分鐘內讀取。